ISOLASI FLAVONOID

Flavonoid adalah senyawa yang terdiri dari dari 15 atom karbon yang umumnya tersebar di dunia tumbuhan. Lebih dari 2000 flavonoid yang berasal dari tumbuhan telah diidentifikasi, namun ada tiga kelompok yang umum dipelajari, yaitu antosianin, flavonol, dan flavon. Antosianin (dari bahasa Yunani anthos , bunga dan kyanos, biru-tua) adalah pigmen berwarna yang umumnya terdapat di bunga berwarna merah, ungu, dan biru . Pigmen ini juga terdapat di berbagai bagian tumbuhan lain misalnya, buah tertentu, batang, daun dan bahkan akar. Flavonoid sering terdapat di sel epidermis. Sebagian besar flavonoid terhimpun di vakuolasel tumbuhan walaupun tempat sintesisnya ada di luar vakuola.

Flavonoid merupakan senyawa fenol alami terbesar. Penyebarannya di alam, kegunaannya dalam kehidupan menjadikan flavonoid adalah senyawa kimia organik yang penting. Senyawa flavonoid adalah senyawa C15 yang terbentuk 2 senyawa fenol yang terhubung dengan 3 unit karbon. Karakteristik dari siklik A adalah pola dari phloroglucinol atau resorcinol hydroxylation dan siklik B biasanya 4-, 3.4-, atau 3,4,5-hydroxylated. (Geissman, 1969) 

Prinsip dari pemisahan (isolasi) adalah adanya perbedaan sifat fisik dan kimia dari senyawa yaitu kecendrungan dari molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), kecenderungan molekul untuk menguap (keatsirian), kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk labus (adsorpsi, penserapan) (Harborne, 1987).

Salah satu cara pemisahan adalah kromatografi cair vakum, kromatografi cair vakum adalah kromatografi kolom yang dipercepat dan bekerja pada kondisi vakum. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung fraksi. Corong G-3 diisi adsorben sampai setinggi 2,5 cm, kemudian diketuk-ketuk dengan batang pengaduk bersalut dilarutkan dalam pelarut organik yang cocok, kemudian ke dalam larutan ekstrak tersebut ditambahkan adsorben dengan bobot sama dengan bobot ekstrak. Campuran ini digenis sampai homogen, dikeringkan dan dimasukkan ke dalam corong G-3 kemudian diratakan. Permukaan lapisan adsorben ditutup dengan kertas saring. Elusi diawali dengan pelarut non polar dilarutkan dengan kombinasi pelarut dengan polaritas meningkat. Jumlah pelarut yang digunakan setiap kali elusi untuk bobot ekstrak sampai lima gram diperlukan 25 ml pelarut, untuk 10-30 gram ekstrak diperlukan 50 ml pelarut. Dalam hal ini, diameter corong dipilih sedemikian rupa sehingga lapisan ekstrak dipermukaan kolom setipis mungkin dan rata. Masing-masing pelarut dituangkan ke permukaan kolom kemudian dihisapkan pompa vakum. Masing-masing ekstrak ditampung dalam wadah terpisah sehingga menghasilkan sejumlah fraksi (Soediro, dkk.,1986).

Ø  Isolasi Flavonoid

Isolasi flavonoid umumnya dilakukan dengan metode ekstraksi, yakni dengan cara maserasi atau sokletasi menggunakan pelarut yang dapat melarutkan flavonoid. Flavonoid pada umumnya larut dalam pelarut polar, kecuali flavonoid bebas seperti isoflavon, flavon, flavanon,dan flavonol termetoksilasi lebih mudah larut dalam pelarut semipolar. Oleh karena itu pada proses ekstraksinya, untuk tujuanskrining maupun isolasi, umumnya menggunakan pelarut methanol atauetanol. Hal ini disebabkan karena pelarut ini bersifat melarutkan senyawa–senyawa mulai dari yang kurang polar sampai dengan polar. Ekstrak methanol atau etanol yang kental, selanjutnya dipisahkankandungan senyawanya dengan tekhnik fraksinasi, yang biasanyaberdasarkan kenaikan polaritas pelarut (Monache, 1996).

Senyawa flavonoid diisolasi dengan tekhnik maserasi,mempergunakan poelarut methanol teknis. Ekstraksi methanol kental kemudian dilarutkan dalam air. Ekstrak methanol–air kemudian difraksinasi dengan n-heksan dan etil asetat. Masing–masing fraksiyang diperoleh diuapkan, kemudian diuji flavonoid. Untuk mendeteksiadanya flavonoid dalam tiap fraksi, dilakukan dengan melarutkansejumlah kecil ekstrak kental setiap fraksi kedalam etanol.Selanjutnya ditambahkan pereaksi flavonoid seperti : natriumhidroksida, asam sulfat pekat, bubuk magnesium–asam klorida pekat,atau natrium amalgam–asam klorida pekat. Uji positif flavonoidditandai dengan berbagai perubahan warna yang khas setiap jenisflavonoid (Geissman, 1962).

Cara lain yang dapat dipakai untuk pemisahan adalah ekstraksi cair-cair, kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas. Isolasi dan pemurnian dapat dilakukan dengan kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas preparatif dengan pengembangan yang dapat memisahkan komponen paling baik (Harborne, 1987). Flavonoid (terutama glikosida) mudah mengalami degradasi enzimatik ketika dikoleksi dalam bentuk segar. Oleh karena itu disarankan koleksi yang dikeringkan atau dibekukan. Ekstraksi menggunakan solven yang sesuai dengan tipe flavonoid yg dikehendaki. Polaritas menjadi pertimbangan utama. Flavonoid kurang polar (seperti isoflavones, flavanones, flavones termetilasi, dan flavonol) terekstraksi dengan chloroform, dichloromethane, diethyl ether, atau ethyl acetate, sedangkan flavonoid glycosides dan aglikon yang lebih polar terekstraksi dengan alcohols atau campuran alcohol air. Glikosida meningkatkan kelarutan ke air dan alkohol-air. Flavonoid dapat dideteksi dengan berbagai pereaksi, antara lain sitrobat, AlCl₃ dan NH₃.

Sebelum melakukan suatu isolasi senyawa, maka yang dilakukan adalah ekstraksi terlebih dahulu. Ekstraksi artinya mengambil atau menarik suatu senyawa yang terdapat dalam suatu bahan dengan pelarut yang sesuai. Proses yang terjadi dalam ekstraksi adalah terlarutnya senyawa yang dapat larut dari sel melalui difusi, tergantung dari letak senyawa dalam sel dan juga permeabilitas dinding sel dari bahan yang akan di ekstraksi.

Ekstraksi adalah suatu proses atau metode pemisahan dua atau lebih komponendengan menambahkan suatu pelarut yang hanya dapat melarutkan salahsatu komponennya saja. Dalam prosedur ekstraksi, larutan berair biasanya dikocok dengan pelarutorganik yang tak dapat larut dalam sebuah corong pemisah. Zat – zatyang dapt larut akan terdistribusi diantara lapisan air dan lapisanorganik sesuai dengan (perbedaan) kelarutannya. Padaekstraksi senyawa – senyawa organik dari larutan berair, selain airatau eter, biasanya digunakan pula etil asetat, benzena, kloroform dan sebagainya. Ekstraksi lebih efisien bila dilakukan berulang kali dengan jumlah pelarut yanglebih kecil dari pada bila jumlah pelarutnya banyak tapi ekstraknyahanya sekali (Markham, 1988).

 Metode ekstraksi terdiri atas dua jenis yakni ekstraksi panas dan ekstraksi dingin. Ekstraksi panas menggunakan cara refluks dan destilasi uap sedangkan ekstraksi secara dingin menggunakan cara maserasi,perkolasi dan soxhletasi.

Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air. Mereka dapat diekstraksi dengan etanol 70 % dan tetap ada dalam lapisan air setelah ekstrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila ditambah basa atau amonia, jadi mereka mudah dideteksipada kromatogram atau dalam larutan (Harborne, 1987 : 70).

 Cara Isolasi Flavonoid Secara Umum

1.  Isolasi Dengan metanol

    Terhadap bahan yang telah dihaluskan, ekstraksi dilakukan dalam dua tahap. Pertama dengan metanol:air (9:1) dilanjutkan dengan metanol:air (1:1) lalu dibiarkan 6-12 jam. Penyaringan dengan corong buchner, lalu kedua ekstrak disatukan dan diuapkan hingga 1/3 volume mula-muIa, atau sampai semua metanol menguap dengan ekstraksi menggunakan pelarut heksan atau kloroform (daIam corong pisah) dapat dibebaskan dari senyawa yang kepolarannya rendah, seperti lemak, terpen, klorofil, santifil dan lain-lain

2.  Isolasi Dengan Charaux Paris

   Serbuk tanaman diekstraksi dengan metanol,lalu diuapkan sampai kental dan ekstrak kental ditambah air panas dalam volume yang sama, Ekstrak air encer lalu ditambah eter, lakukan ekstraksi kocok, pisahkan fase eter lalu uapkan sampai kering yang kemungkinan didapat bentuk bebas. Fase air dari hasil pemisahan ditambah lagi pelarut etil. asetat diuapkan sampai kering yang kemungkinan didapat Flavonoid O Glikosida. Fase air ditambah lagi pelarut n - butanol, setelah dilakukan ekstraksi, lakukan pemisahan dari kedua fase tersebut. Fase n-butanol diuapkan maka akan didapatkan ekstrak n - butanol yang kering, mengandung flavonoid dalam bentuk C-glikosida dan leukoantosianin. Dari ketiga fase yang didapat itu langsung dilakukan pemisahan dari komponen yang ada dalam setiap fasenya dengan mempergunakan kromatografi koLom. Metode ini sangat baik dipakai dalam mengisolasi flavonoid dalam tanaman karena dapat dilakukan pemisahan flavonoid berdasarkan sifat kepolarannya.

3.  Isolasi dengan beberapa pelarut.

    Serbuk kering diekstraksi dengan kloroform dan etanol, kemudian ekstrak yang diperoleh dipekatkan dibawah tekanan rendah. Ekstrak etanol pekat dilarutkan dalam air lalu diekstraksi gojog dengan dietil eter dan n-butanol, sehingga dengan demikian didapat tiga fraksi yaitu fraksi kloroform, butanol dan dietil eter.

4.  Identifikasi Dengan Reaksi warna

   a. Uji WILSTATER

Uji ini untuk mengetahui senyawa yang mempunyai inti δ benzopiron. Warna-warna yang dihasilkan dengan reaksi Wilstater adalah sebagai berikut:

- Jingga Daerah untuk golongan flavon.

- Merah krimson untuk golongan fLavonol.

- Merah tua untuk golongan flavonon.

  

  b. Uji BATE SMITH MATECALVE

                    Reaksi warna ini digunakan untuk menuniukkan adanya senyawa   leukoantosianin, reaksi positif jika terjadi warna merah yang intensif atau  warna ungu.

Ø  Contohnya

Isolasi
Penelitian yang dilakukan meliputi pengumpulan dan determinasi bahan, pembuatan simplisia, pemeriksaan karakteristik simplisia, penapisan fitokimia, ekstraksi, pemantauan ekstrak, fraksinasi, pemantauan fraksi, pemurnian, uji kemurnian dan karakterisasi isolat.

Ekstraksi simplisa dilakukan dengan cara panas secara sinambung menggunakan alat Soxhlet. Pelarut yang digunakan berturut-turut n-heksana-etil asetat-etanol. Pemantauan ekstrak dilakukan dengan menggunakan pengembang yang sesuai, penampak bercak H₂SO₄ 10% dalam metanol dan AlCl₃ 5% dalam etanol.

Ekstrak yang terdeteksi mengandung flavonoid dan mempunyai pola kromatogram yang dapat memisahkan semua bercak pada KLT, difraksinasi dengan Kromatografi Cair Vakum menggunakan fase diam silika gel 60 H dan eluen landaian yaitu n-heksana-etil asetat-etanol dengan kepolaran meningkat. Pemantauan fraksi dilakukan dengan menggunakan pengembang yang sesuai, penampak bercak H₂SO₄ 10% dalam metanol dan AlC_l3 5% dalam etanol.

Fraksi-fraksi yang terdeteksi mengandung flavonoid dan memiliki pola kromatogram yang dapat memisahkan semua bercak pada KLT, dimurnikan dengan KLT preparatif menggunakan pengembang yang sesuai. Bagian kanan dan kiri pelat KLT preparatif disemprot dengan AlCl₃ 5% dalam etanol. Pita hasil preparatif diekstraksi dengan metanol, disaring, dipekatkan kemudian diuji kemurniannya dengan KLT tiga pengembangan tunggal dan KLT dua dimensi. Karakterisasi isolat dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri ultraviolet-sinar tampak dan spektrofotometri inframerah.

Hasil penapisan fitokimia simplisia umbi lapis kucai menunjukkan adanya flavonoid, saponin dan steroid/triterpenoid.  Dari ekstrak etil astat diisolasi isolat x yang diperoleh diduga adalah senyawa flavonoid golongan isoflavon yang mengandung gugus C-H alifatik, C=C alifatik, C-O-C, gugus aromatik dan –OH pada posisi atom C no 5 dan atau 3’,4’
( Sekolah Farmasi ITB http://bahan-alam.fa.itb.ac.id )

Permasalahan :

Menurut artikel diatas, Isolasi flavonoid umumnya dilakukan dengan metode ekstraksi, yakni dengan cara maserasi atau sokletasi menggunakan pelarut yang dapat melarutkan flavonoid. Flavonoid pada umumnya larut dalam pelarut polar, kecuali flavonoid bebas seperti isoflavon, flavon, flavanon,dan flavonol termetoksilasi lebih mudah larut dalam pelarut semipolar.

Yang ingin saya tanyakan kenapa flavonoid bebas seperti isoflavon, flavon, flavanon,dan flavonol termetoksilasi lebih mudah larut dalam pelarut semipolar. Apa yang menyebabkan hal itu ? dan bagaimana jika flavonoid bebas di ektraksi menggunakan pelarut polar, apa yang akan terjadi dan bagaimana hasilnya ? tolong jelaskan menurut pendapat anda !