ISOLASI SENAYAWA TERPENOID

     A.   Isolasi Terpenoid

   Terpenoid merupakan komponen penyusun minyak atsiri. Terpenoid secara luas tersebar di alam, sebagian besar ditemukan di tumbuhan tingkat tinggi. Terpenoid terdiri atas beberapa senyawa antara lain minyak atsiri yang tersusun atas monoterpenoid, seskuiterpenoid yang mudah menguap; Triterpenoid yang sukar menguap; Triterpenoid dan steroid yang tidak menguap dan pigmen karetonoid.  

                         

  Dalam tumbuhan biasanya terdapat senyawa hidrokarbon dan hidrokarbon teroksigenasi yang merupakan senyawa terpenoid. Kata terpenoid mencakup sejumlah besar senyawa tumbuhan, dan istilah ini digunakan untuk menunjukkan bahwa secara biosintesis semua senyawa tumbuhan itu berasal dari senyawa yang sama. Jadi, semua terpenoid berasal dari molekul isoprene CH2==C(CH3)─CH==CH2  dan kerangka karbonnya dibangun oleh penyambungan 2 atau lebih satuan C5 ini. Kemudian senyawa itu dipilah-pilah menjadi beberapa golongan berdasarkan jumlah satuan yang terdapat dalam senyawa tersebut, 2 (C10), 3 (C15), 4 (C20), 6 (C30) atau 8 (C40).

   Untuk mengisolasi suatu senyawa kimia yang berasal dari bahan alam hayati pada dasarnya menggunakan metode yang sangat bervariasi, seperti yang diaplikasikan dalam proses industri. Metode pengempaan digunakan pada senyawa katecin dari daun gambir juga isolasi CPO dari buah kelapa sawit.

    Metode ini umum digunakan karena senyawa organik yang diperoleh dengan kuantitas yang cukup banyak. Tetapi berbeda dengan senyawa bahan alam hasil proses metabolit sekunder lainnya yang pada umumnya dengan kandungan yang relatif kecil, maka metode-metode dalam proses industri tersebut tidak dapat digunakan.

   Berdasarkan hal diatas maka metode yang umum dalam isolasi senyawa metabolit sekunder dapat digunakan. Metode standar laboratorium dengan kuantitas sampel terbatas dan perlunya menentukan metode yang paling sesuai dengan maksud tersebut.

Dari identifikasi awal, maka dapat diamati kandungan senyawa dari tumbuhan sehingga untuk isolasi dapat diarahkan pada suatu senyawa yang lebih dominan dan salah satu usaha mengefektifkan isolasi senyawa tertentu maka dapat dimanfaatkan pemilihan pelarut organik yang akan digunakan pada isolasi tersebut, dimana pelarut polar akan lebih mudah melarutkan senyawa polar dan sebaliknya senyawa non polar lebih mudah larut dalam pelarut non polar.

1.        Identifikasi Kandungan Kimia

Sebelum melakukan isolasi terhadap suatu senyawa kimia yang diinginkan dalam suatu tumbuhan maka perlu dilakukan identifikasi pendahuluan kandungan senyawa metabolit sekunder yang ada pada masing-masing tumbuhan, sehingga dapat diketahui kandungan senyawa yang ada secara kualitatif dan mungkin juga secara kuantitatif golongan senyawa yang dikandung oleh tumbuhan tersebut. untuk tujuan tersebut maka diperlukan metoda persiapan sampel dan metoda identifikasi pendahuluan dari senyawa metabolit sekunder, yaitu untuk mengetahui adanya Senyawa Alkaloid dan Senyawa Terpenoid, steroid, fenolik, flavonoid dan saponin.

2.        Ekstraksi dan fraksinasi

Secara umum ekstraksi senyawa metabolit sekunder dari seluruh bagian tunbuhan seperti bunga, buah, daun, kulit batang dan akar menggunakan sistem maserasi menggunakan pelarut organik polar seperti metanol. Beberapa metode ekstraksi senyawa organik bahan alam yang umum digunakan antara lain: Maserasi, Perkolasi, Sokletasi, Destilasi Uap, Pengempaan.

Ekstraksi senyawa terpenoid dilakukan dengan dua cara yaitu: melalui sokletasi dan maserasi.

  Ø Sekletasi

   Dilakukan dengan melakukan disokletasi pada serbuk kering yang akan diuji dengan 5L n-hexana. Ekstrak n-hexana dipekatkanlalu disabunkan dalam 50 mL KOH 10%. Ekstrak n-heksana dikentalkan lalu diujifitokimia dan uji aktifitas bakteri.

  Ø Teknik maserasi menggunakan pelarut methanol.

   Ekstrak methanol dipekatkan lalu dihidriolisis dalam 100 mL HCl 4M. Hasil hidrolisis diekstraksi dengan 5 x 50 mL n-heksana. Ekstrak n-heksana dipekatkan lalu disabunkan dalam 10 mL KOH 10%. Ekstrak n-heksanadikentalkan lalu diuji fitokimia dan uji aktivitas bakteri.

   Uji aktivitas bakteri dilakukan dengan pembiakan bakteri dengan menggunakan jarum ose yang dilakukan secara aseptis. Lalu dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 2mL Muller-Hinton broth kemudian diinkubasi bakteri homogen selama 24 jam pada suhu 35°C. suspensi baketri homogeny yang telah diinkubasi siap dioleskan pada permukaan media Muller-Hinton agar secara merata dengan menggunakan lidikapas yang steril. Kemudian tempelkan disk yang berisi sampel, standartetrasiklin serta pelarutnya yang digunakan sebagai kontrol. Lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35°C. dilakukan pengukuran daya hambat zat terhadap baketri.

   Uji fitokimia dapat dilakukan dengan menggunakan pereaksi Lieberman-Burchard. Perekasi Lebermann-Burchard merupakan campuran antara asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat.

CONTOH ISOLASI TERPENOID PADA LIMONEN KULIT JERUK

ISOLASI LIMONEN DARI KULIT JERUK

   Jeruk merupakan salah satu komoditas perkebunan yang memiliki prospek kualitas yang baik. Di sisi lain, jeruk merupakan jenis buah berkhasiat tinggi dan bermanfaat bagi manusia dimana pada pemanfaatannya tidak hanya pada daging saja, akan tetapi bagian kulitnya juga bisa dimanfaatkan. Secara umum kulit buah jeruk memiliki komponen penyusun dari berbagai senyawa antara lain asam sitrat, asam amino, dan minyak atsiri. Dari ketiga senyawa diatas prosentase kandungan minyak atsiri lebih besar dari asam sitrat maupun asam amino.

  Minyak atsiri merupakan suatu senyawa yang banyak dimanfaatkan di bidang perindustrian seperti minyak wangi/parfum, obat-obatan, kosmetik, dan makanan. Pada minyak atsiri sendiri terkandung beberapa komponen yaitu terpen, sesquiterpen, aldehida, ester, dan sterol dengan rincian komponen sebagai berikut : limonene (94%), mirsen (2%), llinalol (0,5%), oktanal (0,5%), decanal (0,4%), sitronelal (0,1%), neral (0,1%), geranial (0,1%), valensen (0,05%), sinnsial (0,02%), dan sinensial (0,01%). Dari komponen-komponen tersebut limonene memiliki prosentase kandungan terbesar karena limonene merupakan suatu bahan aktif yang paling berperan dari semua senyawa yang dikandung dalam minyak atsiri. Limonene berfungsi untuk campuran bahan makanan, kosmetik, bahan tambahan perasa, aroma tambahan, dll.

   Dari penjelasan diatas kita dapat mengetahui bahwa kandungan limonene pada kulit jeruk memiliki jumlah terbesar, maka kebutuhan akan limonene juga meningkat sehingga diperlukan cara yang efisien dan efektif untuk mendapatkannya.

   §  Limonen

    Limonen adalah hidrokarbon dan diklasifikasikan dalam terpene siklik. Limonen bisa diperoleh dari kulit jeruk. Limonen, seperti monoterpene lain, dapat diperoleh dari pohon tertentu. Limonen dapat didapatkan dari kulit buah jeruk, jintan, adas, dan seledri. Konsentrasi tipikal dari mono terpene di udara di hutan kayu adalah 1 sampai 10 g/m2 (Filipsson et al., 1998). Limonen dibentuk dari geranylpyrophosphate dengan proses siklisasi dari neryl carbocation atau senyawa equivalennya. Ada grade (jenis atau kelas) dari di limonene yaitu food grade dan technical grade. Ketika jeruk dijus, minyak akan diekstrak dari kulit jeruk. Jus akan terpisah dari minyak dan minyak didistilasi untuk mendapatkan komponen tertentu. Hasil dari proses ini disebut food grade d-limonen yang kemurniannya 96 sampai 97% dan mempunyai aroma jeruk. Setelah proses jus, kulit akan diproses dengan ekstraktor. Lebih banyak minyak akan didapatkan dari kulit jeruk. Ketika uap terkondensasi lapisan minyak akan muncul di permukaan air. Hasil dari proses ini disebut technical grade dan didapatkan limonen dengan kemurnian 96 sampai 97% dan mempunyai aroma yang kuat. Kedua produk ini disebutorange terpenes. Food grade d-limonen digunakan untuk produk bagi konsumen sedangkan technical grade digunakan untuk industry. Secara kimiawi, kulit jeruk mengandung atsiri yang terdiri dari berbagai komponen seperti terpen, sesquiterpen, aldehida, ester dan sterol 3 .Rincian komponen minyak kulit jeruk adalah sebagai berikut: limonen (94%), mirsen (2%), llinalol (0,5%), oktanal (0,5%), dekanal (0,4%), sitronelal (0,1%), neral (0,1%), geranial (0,1%), valensen (0,05%), -sinnsial (0,02%), dan ˜-sinensial (0,01%). Sebagian besar minyak atsiri termasuk dalam golongan senyawa organik terpena dan terpenoid yang bersifat larut dalam minyak/lipofil. Bahan aktif yang berperan terutama senyawa limonen yang dikandung minyak atsiri kulit jeruk. Limonen berfungsi melancarkan peredaran darah, meredakan radang tenggorokan dan batuk, dan bahkan bisa menghambaat pertumbuhan sel kanker. Selain limonen, minyak atsiri kulit jeruk juga mengandung lonalol, linalil dan terpinol yang berfungsi sebagai penenang (sedative). Ada pula senyawa sitronela yang berfungsi sebagai penenang dan dapat digunakan sebagai pengusir nyamuk

v Ekstraksi Padat Cair

Ekstraksi padat cair atau leaching adalah transfer difusi komponen terlarut dari padatan inert dari pelarutnya. Proses ini merupakan proses yang bersifat fisik karena komponen terlarut kemudian dikembalikan lagi ke keadaan semula tanpa mengalami perubahan kimiawi. Ekstraksi dari bahan padat dapat dilakukan jika bahan yang diinginkan dapat larut dalam solven pengekstraksi. Prinsip kerja dari ekstraksi padat cair adalah jika suatu komponen dari campuran merupakan padatan yang sangat larut dalam pelarut tertentu dan komponen yang lain secara khusus tidak larut, maka diikuti dengan proses penyaringan. Akan tetapi bila komponen sangat lambat, maka perlu dilakukan pemisahan dengan ekstraksi soxhlet.

v Destilasi

Destilasi adalah suatu proses pemurnian yang didahului dengan penguapan senyawa cair dengan cara memanaskannya, kemudian mengembunkan uap yang terbentuk. Prinsip dasar dari destilasi adalah perbedaan titik didih dari zat-zat cair dalam campuran zat cair tersebut sehingga zat (senyawa) yang memiliki titik didih terendah akan menguap lebih dahulu, kemudian apabila didinginkan akan mengembun dan menetes sebagai zat murni (destilat). Destilasi digunakan untuk memurnikan zat cair, yang didasarkan atas perbedaan titik didih cairan. Pada proses ini cairan berubah menjadi uap. Uap ini adalah zat murni. Kemudian uap ini didinginkan pada pendinginan ini, uap mengembun manjadi cairan murni yang disebut destilat. Terdapat beberapa metode destilasi, yaitu:

A. Destilasi Uap-Air

Penyarian minyak menguap dengan cara simplisia dan air ditempatkan dalam labu berbeda. Air dipanaskan dan akan menguap, uap air akan masuk ke dalam labu sampel sambil mengekstraksi minyak menguap yang terdapat dalam simplisia, uap air dan minyak menguap yang telah terekstraksi menuju kondensor dan akan terkondensasi, lalu akan melewati pipa alonga, campuran air dan minyak menguapakan masuk ke dalam corong pisah, dan akan memisah antara air dan minyak atsiri.

                                    Gambar Set-Up Destilasi Uap-Air      

B. Destilasi Uap

Destilasi uap untuk memurnikan zat/senyawa cair yang tidak larut dalam air, dan titik didihnya cukup tinggi, sedangkan sebelum zat cair tersebut mencapai titik didihnya, zat cair sudah terurai, teroksidasi atau mengalami reaksi pengubahan (rearranagement), maka zat cair tersebut tidak dapat dimurnikan secara destilasi sederhana atau destilasi bertingkat, melainkan harus didestilasi dengan destilasi uap. Destilasi uap adalah istilah yang secara umum digunakan untuk destilasi campuran air dengan senyawa yang tidak larut dalam air, dengan cara mengalirkan uap air ke dalam campuran sehingga bagian yang dapat menguap berubah menjadi uap pada temperatur yang lebih rendah dari pada dengan pemanasan langsung. Untuk destilasi uap, labu yang berisi senyawa yang akan dimurnikan dihubungkan dengan labu pembangkit uap (lihat gambar alat destilasi uap). Uap air yang dialirkan ke dalam labu yang berisi senyawa yang akan dimurnikan, dimaksudkan untuk menurunkan titik didih senyawa tersebut, karena titik didih suatu campuran lebih rendah dari pada titik didih komponen-komponennya.

Dari ketiga metode isolasi yang digunakan, metode destilasi uap-air menghasilkan rendemen minyak tertinggi, disusul oleh destilasi uap dan terendah metode ektraksi padat-cair. Metode destilasi menghasilkan rendemen yang lebih tinggi dari pada metode ekstraksi padat cair karena adanya panas dan tekanan uap yang memecah dingin kantong minyak dengan lebih maksimal. Hasil rendemen yang didapat dari metode destilasi uap dan destilasi uap-air berbeda karena kondisi alat yang digunakan berbeda. Alat destilasi uap-air menggunakan sumber panas yang langsung mengenai bahan sehingga lebih efektif dalam mengekstraksi minyak dari kulit jeruk, sedangkan pada destilasi uap, uap harus dialirkan dari sumber uap ke bahan sehingga pada saat uap mencapai bahan energi panas yang dikandungnya sedikit berkurang.

Metode pres dingin hanya mengandalkan kekuatan alat pres untuk mengepres kulit jeruk dan mengeluarkan minyak. Dengan metode ini tidak semua kantong minyak pecah sehingga seluruh minyak dapat dikeluarkan. Kemampuan alat untuk mengeluarkan minyak juga sangat tergantunng pada ukuran kulit jeruk maka makin banyak kantong minyak yang sudah terpecah setelah perajangan.

Permasalahan :

Menurut artikel di atas pada proses isolasi limonene jeruk menggunakan 3 metode yaitu ekstraksi padat cair, destilasi uap-air dan destilasi uap, dari ketiga metode tersebut metode destilasi uap-air mendapatkan hasil rendemen yang lebih maksimal dibandingkan dua metode lainnya. Menurut anda, apa yang menyebabkan hal tersebut ? tolong jelaskan beserta mekanisme perbedaan kerja dari ketiga metode tersebut sehingga menyebabkan pendapatan hasil rendemen yang berbeda dari ketiga metode tersebut ?

BIOSINTESIS TERPENOID

   Terpenoid merupakan derivat dehidrogenasi dan oksigenasi dari senyawa terpen. Senyawa terpen, pada awalnya merupakan suatu golongan senyawa yang hanya terdiri dari atom C dan H, dengan perbandingan 5 : 8 dengan rumus empiris C₅H₈ (unit isoprena), yang bergabung secara head to tail (kepala ekor). Oleh sebab itu senyawa terpen lazim disebut isoprenoid, Hal ini disebabkan karena kerangka karbonnya sama seperti senyawa isopren. Terpen dapat mengandung dua, tiga atau lebih suatu isoprena.  Molekul-molekulnya dapat berupa rantai terbuka atau siklik. Mereka dapat mengandung ikatan rangkap, gugus hidroksil, gugus karbonil atau gugus fungsional lain. Struktur mirip yang mengandung unsur-unsur lain disamping C dan H disebut terpenoid. Dewasa ini baik terpen maupun terpenoid dikelompokkan sebagai senyawa terpenoid (isoprenoid).

   Terpenoid juga merupakan komponen penyusun minyak atsiri. Minyak atsiri berasal dari tumbuhan yang pada awalnya dikenal dari penentuan struktur secara sederhana, yaitu dengan perbandingan atom hydrogen dan atom karbon dari suatu senyawa terpenoid yaitu 8 : 5 dan dengan perbandingan tersebut dapat dikatakan bahwa senyawa teresbut adalah golongan terpenoid. Minyak atsiri bukanlah senyawa murni akan tetapi merupakan campuran senyawa organic yang kadangkala terdiri dari lebih dari 25 senyawa atau komponen yang berlainan. Sebagian besar komponen minyak atsiri adalah senyawa yang hanya mengandung karbon dan hydrogen atau karbon, hydrogen dan oksigen. Minyak atsiri adalah bahan yang mudah menguap sehingga mudah dipisahkan dari bahan-bahan lain yang terdapat dalam tumbuhan. Salah satu cara yang paling banyak digunakan adalah memisahkan minyak atsiri dari jaringan tumbuhan adalah destilasi. Dimana, uap air dialirkan kedalam tumpukan jaringan tumbuhan sehingga minyak atsiri tersuling bersama-sama dengan uap air. Setelah pengembunan, minyak atsiri akan membentuk lapisan yang terpisah dari air yang selanjutnya dapat dikumpulkan. Minyak atsiri terdiri dari golongan terpenoid berupa monoterpenoid (atom C 10) dan seskuiterpenoid (atom C 15).

Secara umum terpenoid terdiri dari unsur-unsur C dan H dengan rumus molekul umum (C₅H₈)_n.

Klasifikasi biasanya tergantung pada nilai n.

Nama	Rumus	Sumber
Monoterpen	C10H16	Minyak Atsiri
Seskuiterpen	C15H24	Minyak Atsiri
Diterpen	C20H32	Resin Pinus
Triterpen	C30H48	Saponin, Damar
Tetraterpen	C40H64	Pigmen, Karoten
Politerpen	(C5H8)n  n  8	Karet Alam

   Dari rumus di atas sebagian besar terpenoid mengandung atom karbon yang jumlahnya merupakan kelipatan lima. Penyelidikan selanjutnya menunjukan pula bahwa sebagian besar terpenoid mempunyai kerangka karbon yang dibangun oleh dua atau lebih unit C₅ yang disebutunit isopren. Unit C₅ ini dinamakan demikian karena kerangka karbonnya seperti senyawa isopren. Wallach (1887) mengatakan bahwa struktur rangka terpenoid  dibangun oleh dua atau lebih molekul isopren. Pendapat ini dikenal dengan “hukum isopren”.

   Ingold (1925) mengatakan pula bahwa isopren unit yang terdapat di alam  masing-masing bergabung dengan ikatan “head to tail” yang bahagian ujung suatu molekul berikatan dengan bagian kepala molekul isopren lainnya.    

Beberapa contoh terpenoid :

Monoterpen :

Seskuiterpen : 

Politerpen :

 Terpenoid Tak Teratur :

  

   Usaha untuk menemukan senyawa isopren biologis yang sesungguhnya digunakan oleh organisme untuk sintesa terpenoid dilakukan oleh banyak peneliti selama bertahun-tahun. Masalah ini akhirnya dapat diselesaikan oleh J.W. Cornforth pada tahun 1959 dari penyelidikan-penyelidikannya dibidang steroid. Conforth menemukan dua bentuk isoprene yang aktif, yakni isopentenil pirofosfat (IPP) dan dimetilalil pirofosfat (DMAPP). Kedua isopren aktif ini harus ada untuk keperluan sintesa terpenoid oleh organisme.

   Penyelidikan-penyelidikan selanjutnya oleh para ahli menunjukan bahwa IPP dan DMAPP berasal dari asam mevanolat. Selanjutnya diketahui pula bahwa satu-satunya sumber karbon bagi asam mevanolat, begitu pula IPP dan DMAPP ialah asam asetat atau turunannya yang aktif, yakni asetil pirofosfat. Mekanisme dari tahap-tahap reaksi biosintesa terpenoid, pada waktu ini sudah diketahui dengan baik dan tercantum pada Gambar

 

   Mekanisme dari tahap-tahap reaksi biosintesis terpenoid adalah asam asetat setelah diaktifkan oleh koenzim A melakukan kondensasi jenis Claisen menghasilkan asam asetoasetat. Senyawa yang dihasilkan ini dengan asetil koenzim A melakukan kondensasi jenis aldol menghasilkan rantai karbon bercabang sebagaimana ditemukan pada asam mevalinat, reaksi-reaksi berikutnya adalah fosforilasi,eliminasi asam fosfat dan dekarboksilasi menghasilkan isopentenil (IPP) yang selanjutnya berisomerisasi menjadi dimetil alil piropospat (DMAPP) oleh enzimisomeriasi. IPP sebagai unit isoprene aktif bergabung secara kepala ke ekor dengan DMAPP dan penggabungan ini merupakan langkah pertama dari polimerisasi isoprene untuk menghasilkan terpenoid.Penggabungan ini terjadi karena serangan electron dari ikatan rangkap IPP terhadap atom karbon dari DMAPP yang kekurangan electron diikuti olehpenyingkiran ion pirofosfat yang menghasilkan geranil.pirofosfat (GPP) yaitu senyawa antara bagi semua senyawa monoterpenoid.Penggabungan selanjutnya antara satu unti IPP dan GPP dengan mekanisme yang sama menghasilkan Farnesil pirofosfat (FPP) yang merupakan senyawaantara bagi semua senyawa seskuiterpenoid. Senyawa diterpenoid diturunkan dariGeranil-Geranil Pirofosfat (GGPP) yang berasal dari kondensasi antara satu unit IPP dan GPP dengan mekanisme yang sama.

   Secara umum biosintesa dari terpenoid terjadi 3 reaksi dasar yaitu:
1.Pembentukan isoprene aktif berasal dari asam asetat melalui asam mevalonat.
2.Penggabungan kepala dan ekor dua unit isoprene akan membentuk mono-,seskui-, di-. sester-, dan poli-terpenoid.

3.Penggabungan ekor dan ekor dari unit C-15 atau C-20 menghasilkan triterpenoid dan steroid.

                                                                                                                                   

Permasalahan :

Menurut literature yang saya dapatkan pembentukan isoprena aktif berasal dari asam asetat melalui asam mevalonat. Asam asetat setelah diaktifkan oleh koenzim A (Ko-A) melakukan kondensasi jenis Claisen menghasilkan Asetoasetil Ko-A. Senyawa ini dengan Asetil Ko-A melakukan kondensasi jenis Aldol menghasilkan rantai karbon bercabang sebagaimana ditemukan pada asam mevalonat. Hal ini menunjukan bahwa koenzim A (Ko-A) bersifat sebagai katalis.

Yang ingin saya tanyakan, apabila asam asetat di aktifkan menggunakan katalis yang lain seperti NADH, FADH atau vit B, yang juga merupakan koenzim yang berasal dari gugus prostetik terdiri atas senyawa organic kompleks, apakah akan dapat membentuk asam mevalonat juga ? jika iya, tolong jelaskan mekanismenya, jika tidak, tolong jelaskan alasannya !